O citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação da emissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated Cell Sorter). Alguns aparelhos são capazes de separar fisicamente as células, de acordo com as características citométricas. As células da amostra em suspensão são marcadas com reagentes fluorescentes específicos para detecção de moléculas de superfície e são introduzidas numa câmara de fluxo vibratória. O fluxo de células que atravessa a câmara é envolvido por uma solução tampão, sendo que 500 a 4000 células ou partículas passam em fila simples por segundo por meio do sensor eletrônico. O fluxo é iluminado por laser de argônio (azul), que tem uma energia de luz incidente de 488nm. Cada célula é avaliada com relação ao tamanho (dispersor de luz anterior) e granulosidade (dispersor de 90°) e para intensidade de fluorescência para detecção de antígenos de superfície diferentes (imunofenotipagem). A vibração do fluxo celular provoca o rompimento em gotículas que podem ser carregadas eletricamente e, a partir daí, dirigidas por placas de deflexão eletromagnética para serem coletadas em diferentes populações celulares de acordo com os parâmetros medidos, sob controle de um computador.
Fundamentos da técnica da citometria de fluxo
A citometria de fluxo pode ser usada para identificação de determinadas células em suspensão, promovendo a identificação e a quantificação de células pelo tamanho, granulosidade e intensidade de fluorescência destas células. A avaliação do tamanho relativo da célula (“Forward scatter – FSC”) e da granulosidade ou complexidade interna da célula (“Side Scatter – SSC”) permite a classificação dos leucócitos em linfócitos, monócitos e granulócitos. A imunofenotipagem consiste no isolamento de populações de células distintas com diferentes antígenos de superfície marcados com anticorpos fluorescentes específicos. A avaliação da intensidade de fluorescência ocorre para detecção de antígenos de superfície diferentes marcados com anticorpos monoclonais específicos ligados a compostos químicos fluorescentes ou fluorocromos.
Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e reprodutibilidade. O termo CD (Cluster Designation= denominação de grupamento) é utilizado para denominar os anticorpos monoclonais criados em diferentes laboratórios de todo o mundo contra antígenos leucocitários humanos.