O sequenciamento Shotgun, também conhecido como clonagem Shotgun, é um método para sequenciamento de fitas longas de DNA.
Nesse método, o genoma inteiro é picotado em pedaços de alguns poucos milhares de pares de bases e clonado em plasmídeos.
Ocorre então sequenciamento das duas extremidades de cada clone (pelo método de terminação em cadeia), e utilizando-se a informação de sequência e a estimativa de distância entre as duas pontas do clone busca-se montar o genoma inteiro.
Múltiplas leituras sobrepostas para o DNA-alvo são obtidas com várias rodadas desta fragmentação e sequenciamento. Programas de computador, em seguida, usam as extremidades sobrepostas de diferentes leituras para reuni-las em uma sequência contínua