O procedimento de coloração de Gram permite que as bactérias retenham a cor com base nas diferenças nas propriedades químicas e físicas da parede celular. O uso dos corantes permite aumentar o contraste e evidenciar a estrutura bacteriana.
Há diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e Gram-negativos. As bactérias Gram-positivas retêm o cristal violeta devido à presença de uma espessa camada de peptidoglicano (polímero constituído por açúcares e aminoácidos que originam uma espécie de malha na região exterior à membrana celular das bactérias) em suas paredes celulares, apresentando-se na cor roxa.
Já as bactérias Gram-negativas possuem uma parede de peptidoglicano mais fina que não retém o cristal violeta durante o processo de descoloração e recebem a cor vermelha no processo de coloração final.