Durante a 2ª Guerra Mundial, a Estrada de Ferro Madeira-Mamoré voltou a ter grande valor estratégico para o Brasil, operando plenamente para suprir o transporte de borracha, utilizada no esforço de guerra aliado. Em 1957, quando ainda registrava um intenso tráfego de passageiros e cargas, a ferrovia integrava as dezoito empresas constituintes da Rede Ferroviária Federal.
Em 25 de maio de 1966, depois de 54 anos de atividades, a Estrada de Ferro Madeira-Mamoré teve sua desativação determinada pelo então Presidente da República Humberto de Alencar Castelo Branco. A ferrovia deveria ser, porém, substituída por uma rodovia, a fim de que não se configurasse rompimento e descumprimento do Acordo celebrado em Petrópolis, em 1903. Tal rodovia materializou-se nas atuais BR-425 e BR-364, que ligam Porto Velho a Guajará-Mirim. Duas de suas pontes metélicas ainda servem ao tráfego de veículos. Em 10 de julho de 1972 as máquinas apitaram pela última vez. A partir daí, o abandono foi total e, em 1979, o acervo começou a ser vendido como sucata para a siderúrgica de Mogi das Cruzes, em São Paulo.