A eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida é o método mais eficiente de separação simultânea de centenas ou milhares de proteínas. Na eletroforese bidimensional, as proteínas são submetidas a dois processos consecutivos (duas dimensões) de separação, baseados em propriedades diferentes das proteínas. Assim, durante a primeira dimensão, denominada focalização isoelétrica (IEF), as proteínas são separadas em um gel de poliacrilamida, que forma um gradiente de pH, e migram até atingirem uma posição estacionária onde possuam carga líquida zero (ponto isoelétrico). Na segunda dimensão, as proteínas separadas pela IEF são submetidas a uma eletroforese desnaturante em gel de poliacrilamida, que separa as proteínas de acordo com suas massas moleculares. Como os parâmetros usados na primeira dimensão (ponto isoelétrico) e na segunda dimensão (massa molecular) são independentes, uma grande resolução é atingida. Mais de 8.000 proteínas podem ser separadas em um único gel bidimensional.