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a) ocorre a ligação reversível do DNA a superfície sólida/grânulo/partícula magnética, que tenha sido revestida com anticorpo de ligação ao DNA. ERRADO. Princípio da extração magnética do DNA.
b) ocorre interação específica entre fosfatos carregados negativamente do acido nucleico e moléculas carregadas positivamente na superfície do substrato sólido. ERRADO. Princípio da troca iônica.
c) o DNA purificado é eluído por extração com etanol. ERRADA. O DNA é eluído com fenol:clorofórmio, enquanto o etanol é usado na etapa de concentração, onde o DNA é precipitado. O etanol retira o esqueleto de hidratação do DNA, expondo os fosfatos negativos, que interagem com os cátions do meio e levando à precipitação.
d) as proteínas são desnaturadas, utilizando-se proteases, e removidas com solventes orgânicos como fenol, ou com uma mistura de 1:1 de fenol e clorofórmio. CORRETA. O fenol extrai as proteínas e lipídeos. Lipídeos ficam na fase orgânica com o solvente, proteínas na fase intermediária e o DNA solúvel no sobrenadante. O clorofórmio é usado para aumentar a densidade e facilitar a separação.
e) o DNA adsorve especificamente membranas/superfícies/ /partículas de sílica em presença de certos sais e em um determinado pH. ERRADO. Descrição do método de extração de DNA por adsorção à sílica, onde os sais caotrópicos expõem os fosfatos negativos do esqueleto do DNA, que passam a interagir com a síilica, extraindo seletivamente o DNA.
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Extração orgânica. É amplamente utilizado e é o método convencional para extração de DNA. Na primeira etapa, as células são lisadas e os restos são removidos por centrifugação. As proteínas são então desnaturadas utilizando proteases e removidas com solventes orgânicos como fenol, ou uma mistura de 1:1 de fenol e clorofórmio. Os solventes orgânicos precipitam as proteínas, que são separadas dos polinucleotídeos (DNA e RNA) por centrifugação. Na ultima etapa, o DNA purificado é normalmente recuperado por precipitação utilizando etanol ou isopropanol. Na presença de cátions monovalentes como Na+, e numa temperatura < ou igual a 20°C, o etanol absoluto precipita eficientemente o DNA. Outra propriedade da precipitação com etanol é que ele precipita apenas ácidos nucleicos poliméricos e deixa para trás pequenas cadeias ou componentes monoméricos de ácidos nucleicos, incluindo ribonucleotídeos de RNase. O DNA precipitado é comumente resuspendido em tampão TE ou água bidestilada. As limitações deste método são o uso de solventes orgânicos perigosos, e seu tempo consumido. Alem do mais, fenol residual ou clorofórmio podem estar presente no DNA extraído, que pode inibir seu uso em aplicações downstream como a PCR. Um exemplo de kit baseado neste método é o Easy-DNA® (Invitrogen).
Tecnologia baseada em sílica. Muito empregada nos kits atuais, o DNA adsorve especificamente a membranas/superfícies/partículas de sílica em presença de certos sais e em um determinado pH. Os contaminantes celulares são removidos por etapas de lavagens e o DNA pode finalmente ser eluído em um tampão com baixa concentração de sal ou em um tampão de eluição. Sais caotrópicos são adicionados para ajudar na desnaturação das proteínas e extração do DNA. A vantagem desta tecnologia é que ela pode ser incorporada em spin columns e micro chips, é rentável, tem um procedimento simples rápido (comparado com a extração orgânica) e pode ser automatizada. Os kits baseados neste método incluem o Purelink Genomic DNA extraction (Invitrogen), DNeasy Blood e Tissue Kit (Qiagen), etc.
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Separação magnética. Este método é baseado na ligação reversível do DNA a uma superfície sólida/grânulo/partícula magnética, que foi revestida com anticorpo de ligação ao DNA ou a grupo funcional que interage especificamente com o DNA. Após a ligação do DNA, as partículas são separadas de outros componentes celulares contaminantes, lavadas e então o DNA purificado é eluído por extração com etanol. A maior vantagem deste método é que é rápido e pode ser automatizado. No entanto pode ser mais caro em comparação a outras metodologias mencionadas anteriormente. Exemplos de kits baseados neste método são Agencourt DNA Advance Kit (Beckaman Coulter), Magnetic Beads Genomic DNA Extraction Kit (Geneaid), etc.
Tecnologia de troca iônica. Este método é baseado na interação específica entre fosfatos carregados negativamente do acido nucleico e moléculas carregadas positivamente na superfície do substrato. O DNA se liga especificamente ao substrato na presença de baixa concentração de sal, os contaminantes são removidos por etapas de lavagem utilizando tampões com baixa a média concentração de sal, e o DNA purificado é eluído utilizando um tampão com alta concentração de sal. Esta tecnologia é mais empregada em kits de isolamento de plasmídeos, como PureLink® HiPure Plasmid DNA Purification kit (Invitrogen), Qiagen plasmid mini/midi kits (Qiagen) e NucleoBond® PC kits (Macherey Nagel).
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A) Ligação reversível / superfície magnética - separação magnética
B) Fosfatos negativos do ác. nucleico + moléculas positivas - troca iônica
C) O álcool é utilizado para precipitar o DNA. Para recuperá-lo, é usado água ultrapura ou tampão TE
D) Certin
E) Adsorve especificamente membranas de sílica nas presença de certos sais e em determinado pH - baseada em sílica
Coloquei algumas palavras-chave que utilizo para estudar. Espero que ajude! Qualquer erro, por favor, me corrijam.