TÉCNICA DO POLIMORFISMO POR RFLP
O polimorfismo por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), rusticamente traduzido como ‘Polimorfismo no Comprimento do Fragmento de Restrição, é uma técnica bastante utilizada para o estudo do genoma, pois indivíduos diferentes possuem sequências de nucleotídeos diferentes ao longo da fita de DNA.
Nesta técnica utilizam-se enzimas de restrição que cortam o DNA em pontos específicos, gerando fragmentos de diferentes tamanhos que são separados e visualizados em forma de bandas.
A separação é feita por eletroforese, na qual os fragmentos de DNA são colocados em um gel de agarose e expostos a cargas elétricas, positivas de um lado e negativas do outro, onde eles migram de acordo com seu tamanho. Assim, fragmentos menores migram mais rápido que os maiores. Eles também migram de acordo com sua carga elétrica, o DNA, por possuir carga negativa em pH neutro, migra em direção ao ânodo.
A visualização pode ser feita com brometo de etídio, coloração por prata, material radiativo ou Southern blot.
O brometo de etídio intercala a molécula de DNA e sua visualização é através da exposição à luz ultravioleta. A coloração por prata é mais trabalhosa, contudo mais sensível, chegando a detectar quantidades relativamente pequenas de DNA. O material radioativo é visualizado pela exposição do gel a um filme de raio X e detecta pequenos fragmentos facilmente.
E por último, a visualização por Southern blot é usada para matérias mal preservados ou com quantidades muito pequenas, os fragmentos são transferidos para uma membrana, de náilon ou nitrocelulose, que é hibridada com uma sonda de DNA, fria ou radioativa, revelados pela exposição da membrana a um filme de raio X no caso da fria, ou por imunoensaio e precipitação de corante no caso da radioativa, respectivamente.
Cada individuo apresentará o seu padrão de fragmentos, chamado ‘perfil de digestão’, detectado pelo número e tamanho dos fragmentos gerados.
Fonte: http://www.ebiotecnologia.org