O procedimento de PCR envolve três etapas, cada uma repetida muitas vezes.
1 – DESNATURAÇÃO: O DNA genômico contendo a sequência a ser amplificada é desnaturado por aquecimento a cerca de 95°C por cerca de 30 segundos. A dupla fita é aberta (desnaturada), tornando-se uma fita única.
2 – ANELAMENTO OU HIBRIDIZAÇÃO: Após a separação das fitas, um par de iniciadores ou primers (uma fita de DNA específica para o gene que se quer estudar) complementam a fita oposta da sequência de DNA a ser amplificada. Ou seja, um deles é complementar à sequência em uma fita da dupla-hélice de DNA e o outro é complementar à sequência na outra fita. O molde é determinado pela posição dos iniciadores que se anelam a fita. Essa etapa ocorre a uma temperatura de 60°C.
3 – EXTENSÃO OU POLIMERIZAÇÃO: Com o molde já identificado, a enzima DNA-polimerase adiciona as bases complementares, formando uma nova fita e então tem-se novamente a duplicação da fita de DNA. Esse processo acontece a uma temperatura de 72°C.
O ciclo inteiro é então reiniciado, os produtos do primeiro ciclo de replicação são então desnaturados, hibridizados e novamente replicados com DNA-polimerase. O procedimento é repetido muitas vezes até que o nível desejado de amplificação seja obtido.
Na prática, a amplificação efetiva do DNA requer de 20 a 30 ciclos de reação, com os produtos de cada ciclo servindo como DNA-molde para o próximo – dando origem ao termo “reação em cadeia” da polimerase.
Como cada etapa da reação ocorre em uma temperatura específica, a reação pode ser controlada. É utilizado um termociclador para determinar a temperatura e o tempo de cada etapa, bem como o número de ciclos de replicação.
A detecção do produto de amplificação normalmente é feita em eletroforese em gel de agarose, que é corado com brometo de etídio, permitindo a visualização direta do DNA pesquisado. Hoje, existem termocicladores que, além de amplificar o DNA, permitem a sua detecção – chamada PCR em tempo real (qPCR).
Fonte: https://kasvi.com.br/3-etapas-pcr/