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Método de extração fenol-clorofórmio (extração orgânica).
Este método gera grande quantidade de DNA ao remover proteínas e lipídios baseando-se nas diferenças de afinidade pelo solvente (fenol) que possui densidade aumentada pelo clorofórmio.
Etapas:
Lise de membranas e componentes proteicos por SDS e proteinase K;
Adição de fenol-clorofórmio para promover separação das proteínas do DNA por precipitação (fenol é um solvente que possui densidade aumentada pelo clorofórmio).
Há formação de um gradiente com camada inferior ( lipídios ), camada intermediária (proteinas) e camada superior (DNA).
Alternativa letra B.
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Essa questão cita a extração do DNA
como etapa importante para utilização como prova em processos, e cita que podem
ser utilizadas combinações de reagentes além dos kits comerciais. A questão
pede a alternativa correta sobre as características do método de extração por fenol/clorofórmio. A extração de DNA
pode ser realizada através de métodos variados, e basicamente possui duas
etapas: a lise e a purificação do DNA. A lise rompe
as membranas celulares liberando o conteúdo das células e a purificação separa
os DNA das organelas e compostos utilizados no processo. Na extração com
fenol/clorofórmio, ocorre a lise das membranas celulares, a desnaturação das
proteínas com fenol e clorofórmio com a utilização da proteinase K e posterior
precipitação do DNA liberado com adição de álcool etílico ou isopropanol. (Silva,
Angélica O. Avaliação de protocolos de
extração e purificação de dna Alvo da reação em cadeia da polimerase na detecção de Leishmania (Viannia) spp. Fundação Oswaldo
Cruz. Centro De Pesquisas Aggeu Magalhães. Dissertação. Recife, 2017.
Disponível em https://www.cpqam.fiocruz.br/bibpdf/2017silva-ao.pdf.
Acesso em junho de 2021)
Fonte da imagem: site ppg.qui.ufmg.br
Considerando a extração que emprega o Fenol/ Clorofórmio, referente às características desse método, assinale a alternativa correta.
A) Tem níveis baixos de toxicidade dos
reagentes e alto custo por reação, comparado a outras técnicas de extração.
Esse método tem baixo custo por reação, sendo amplamente utilizado em reações
de extração de DNA. Incorreta.
B) Lise celular e remoção de resíduos de
proteínas por precipitação são etapas dessa extração. A lise celular é
a primeira etapa dessa extração, e a precipitação a última. CORRETA.
C) Utiliza o etanol para promover a lise
celular e desnaturação das proteínas. O etanol não é utilizado na lise celular,
e a desnaturação das proteínas ocorre com a utilização do fenol e clorofórmio. Incorreta.
D) Utiliza a
proteinase K para a precipitação do DNA. A proteinase K é utilizada antes da
etapa de precipitação, na desnaturação das proteínas e lise celular. Incorreta.
E) Ocorre obtenção rápida do DNA, mas
com baixo grau de pureza. A obtenção do DNA ocorre com alto grau de pureza.
Incorreta.
Gabarito do Professor: Letra B.
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Para quem gosta de comentários englobando todas as alternativas (como eu), vamos lá:
A) Tem níveis baixos de toxicidade dos reagentes e alto custo por reação, comparado a outras técnicas de extração.
- Na verdade é uma desvantagem do método utilizar reagentes tóxicos, além disso, possui baixo custo.
- Outras obs.: é um método demorado, sujeito a contaminação e troca de amostras, não permite automação e produz grande quantidade de DNA, mas de baixa pureza.
B) Lise celular e remoção de resíduos de proteínas por precipitação são etapas dessa extração.
- Como a colega Meclycia já pontuou, são etapas da extração.
C) Utiliza o etanol para promover a lise celular e desnaturação das proteínas.
- Na verdade é utilizado SDS e proteinase K para isso. O etanol pode sim ser utilizado, mas com o objetivo de reduzir as espumas produzidas e na precipitação da amostra.
D) Utiliza a proteinase K para a precipitação do DNA.
- Na verdade é utilizado o etanol, a proteinase K tem como função romper ligações peptídicas.
E) Ocorre obtenção rápida do DNA, mas com baixo grau de pureza.
- Dentre outras desvantagens do método, temos: a demora na obtenção e o baixo grau de pureza
FONTE: Material de Apoio - Extração do DNA - MAPA Concursos