Gabarito D.
a) Os ddNTPs são desprovidos de do grupo 3-hidroxila e por isso quando adicionados a uma fita em crescimento impedem que esta continue a se replicar;
b) O método Sanger é um método tradicional de sequenciamento de DNA;
c) Na reação, a presença de ddNTPs não dispensa a adição de desonucleotídeos trifosfatos normais. Ambos são adicionados para que a reação possa ocorrer, sendo a concentração dos ddNTPs menor que a concentração dos dNTPs;
d) correta;
e) O pirosequenciamento é uma nova técnica da Biologia Molecular, na qual a síntese de DNA ocorre através de um complexo de reações que inclui enzimas (ATP sulfurilase e luciferase) e substratos (adenosina 5’ fosfossulfato e luciferina). O grupo pirofosfato, liberado durante a adição de um nucleotídeo, resulta na produção de luz detectável. Portanto, quando um novo nucleotídeo é incorporado em uma cadeia crescente de DNA através da DNA polimerase, pirofosfato é gerado de maneira estequiométrica, resultando na produção de ATP. O ATP produzido leva à conversão enzimática da luciferase com emissão de fótons.
A questão pede a alternativa correta em
relação às técnicas de sequenciamento do DNA e suas características. O
sequenciamento de DNA é um processo para determinar a sequência de bases
(nucleotídeos) em um pedaço de uma molécula de DNA, sendo possível conhecer a
sequência de bases nucleotídicas (A, G, C, T) dentro do ácido nucleico. Esse
procedimento ocorre quebrando o DNA em pequenos fragmentos, sequenciando esses
pedaços e montando sequências em uma única nova sequência. O método de
sequenciamento de Frederick Sanger (método enzimático ou de Sanger) é um dos
mais utilizados até hoje, e consiste em adicionar didesoxiribonucleotídeos
(ddNTP's), nucleotídeos modificados que não possuem o grupo OH livre no carbono
3' pentose, para que quando os ddNTP's tentem se ligar com a fita de DNA, o nucleotídeo
mais próximo não tenha onde se conectar sem o grupo OH, parando a replicação e
sendo possível obter fitas do mesmo DNA com número diferente. No final da replicação,
resultam fragmentos de diferentes tamanhos da fita de DNA que são aplicados em
gel de poliacrilamida e separados em eletroforese. Nesse método ocorrem quatro
diferentes reações correspondentes aos didesoxinucleotídeos das bases A, C, G
e T, terminando a sequência de DNA quando incorporados, sendo o oposto do que
ocorre no desoxinucleotídeo normal.
Fonte da imagem: site biometrix.com.br
Em cada tubo de reação de sequenciamento
no método de Sanger temos:
• Um molde de DNA para sequenciar
• A sequência do iniciador (primer)
• DNA-polimerase (enzima)
• Os quatro desoxinucleotídeos trifosfatos
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
• Um didesoxinucleotídeo trifosfato
marcado radiotivamente ou por um corante fluorescente
• O primer ou iniciador marcado é
adicionado ao DNA unifilamentar cuja sequência é desconhecida.
• A enzima DNA-polimerase adiciona
bases livres ao DNA unifilamentar, usando o pareamento de bases complementares.
(Sequenciamento de DNA: Desvendando o código da vida. Disponível em https://www.biometrix.com.br/sequenciamento-dna-de....
Acesso em junho de 2021; Borges, Júlio C. Sequenciamento de DNA e suas
aplicações. Disponível em https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/2346804....
Acesso em junho de 2021)
Assinale a alternativa correta.
A) O método de dideoxinucleotídeos
utiliza o grupo 3-hidroxila. Esse método de adicionar
didesoxiribonucleotídeos NÃO utiliza o grupo 3-hidroxila. Incorreta.
B) O método Sanger também é conhecido
como sequenciamento de nova geração. Esse método é o tradicional que
realiza o sequenciamento, o método de sequenciamento de nova geração é o mais
recente, também conhecido como Next-Generation
Sequencing (NGS). Incorreta.
C) A presença de ddNTPs na reação
dispensa a adição de desoxinucleotídeos trifosfato normais. Os ddNTPs
não dispensam a adição dos desoxinucleotídeos normais, uma vez que eles também
participam do processo de sequenciamento de Sanger. Incorreta.
D) Os fragmentos resultantes são separados
eletroforeticamente e submetidos à autorradiografia. No final do
sequenciamento, os fragmentos que resultaram são separados por eletroforese e
analisadas por autorradiografia para serem lidos. CORRETA.
E) A utilização de vetores plasmidiais,
em técnicas de subclonagem de fragmentos de DNA, é denominada
“pirossequenciamento". O pirosequenciamento consiste em uma nova técnica da
Biologia Molecular onde a síntese de DNA acontece por reações e substratos, não
utiliza vetores plasmidiais (DNA em forma de plasmídeos). Incorreta.
Gabarito do Professor: Letra D.