Regiões de DNA com até 900900900 pares de base de comprimento são rotineiramente sequenciados pelo chamado método Sanger de sequenciamento ou método de terminação da cadeia. O método Sanger foi desenvolvido pelo bioquímico britânico Fred Sanger e seus colaboradores, em 1977.
No Projeto Genoma Humano, o método Sanger foi usado para determinar as sequencias de muitos fragmentos relativamente pequenos de DNA humano. (Esses fragmentos não tinham necessariamente 900900900 pb ou menos, mas os pesquisadores conseguiam "caminhar" ao longo de cada fragmento usando diversas rodadas de sequenciamento por Sanger.) Os fragmentos foram alinhados com base nas porções de sobreposição compondo sequencias de regiões mais longas de DNA e, eventualmente, os cromossomos inteiros.
Embora os genomas sejam agora tipicamente sequenciados usando outros métodos mais rápidos e baratos, o método Sanger ainda é amplamente usado para o sequenciamento de fragmentos individuais de DNA, como fragmentos usados na Clonagem de DNA ou gerados pela Reação em Cadeia da Polimerase(PCR).
Ingredientes para o sequenciamento de Sanger
O método Sanger envolve a produção de muitas cópias de uma região alvo de DNA. Os ingredientes são similares àqueles usados para replicação de DNA em um organismo, ou para a reação em cadeia da polimerase (PCR), os quais fazem cópias de DNA in vitro. Eles incluem:
Uma enzima DNA polimerase
Um primer, que é um pequeno fragmento de DNA de fita simples que se liga ao DNA molde e atua como um "iniciador" para a polimerase
Os quatro nucleotídeos do DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
O DNA molde a ser sequenciado
Entretanto, uma reação de sequenciamento de Sanger contém um ingrediente único:
Versões Dideoxi, ou terminadores de cadeia, para os quatro nucleotídeos (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP), cada uma marcada com um corante de uma cor diferente